【摘要】目的：本实验组着重研究冻融上清体外处理B16细胞后对其成瘤特性/体外增殖的影响，初步探讨其作用环节。 方法：制备肿瘤细胞低渗冻融上清，以此上清体外处理B16黑色素瘤细胞，细胞计数法和MTT法检测细胞增殖及活性；体外处理细胞后，将细胞经尾静脉注射接种至小鼠复制血源性肿瘤转移模型，计数肺部转移结节数量检验细胞体内转移成瘤能力的改变。结果：体外用冻融上清处理的B16细胞和冻融上清混合注射的B16细胞体内成瘤速度比对照组明显加快，而实体瘤内注射冻融上清对肿瘤的生长速度影响不明显。体外实验结果显示，冻融上清能促进B16细胞增殖。
【关键词】黑色素瘤；肿瘤生长；冻融上清；增殖
肿瘤组织中有大量正常死亡或经放化疗死亡的细胞，这种慢性非程序性死亡的细胞向肿瘤微环境中释放“危险信号”，能引起局部炎症反应，产生新的血管、基质和上皮细胞的增生（ref），随后而来的往往是更具增殖和侵袭能力的肿瘤细胞的再生（ref），这说明细胞坏死可能对肿瘤细胞本身或宿主细胞起着不断影响的作用，使得肿瘤细胞的生物学特性发生改变，或创造有利环境以利于肿瘤的快速发展。本实验采用体外接种实验和B16增值实验，借鉴HMGB-1（由坏死细胞释放）释放途径（原始文献：Cancer Lett .2006,235(1):75-83），建立肿瘤坏死模型，研究将冻融上清以不同形式体外处理肿瘤细胞后细胞体内成瘤特性的改变，旨在证明冻融上清能促进肿瘤细胞的增殖。
1材料和方法
1.1 细胞
1.2体外处理细胞后接种实验：
首先制备细胞低渗冻融上清：将6×106 个B16细胞经PBS洗涤后重悬于400μL TdH20中，漩涡震荡30s,4℃静置4h，转入-20℃过夜，次日从-20℃转入4℃静置4h，然后放室温自然解冻，漩涡震荡30s,7000rpm×10min离心，收集上清，命名为B16低渗冻融上清；将B16细胞接种到6孔板（接种量为1×105/孔），分实验组和对照组分别培养，实验组加入终浓度20ul/m的B16细胞冻融上清，对照组加入等弄度等体积的PBS，3天后取出细胞，PBS洗涤后用生理盐水重悬，将细胞调整至浓度：1 ×106/ml；取两组小鼠，每组7只，第一组作为实验组分别尾部静脉注射1 ×106/ml细胞悬液100ul ，接种量为 1 ×105/ 只；第二组作为对照组分别尾部静脉注射等浓度生理盐水100ul，15d后处死小鼠取肺组织，观察B16细胞在肺表面形成转移结节数量差异。
1.3 B16增殖实验：
体外培养小鼠B16细胞，将对数生长期细胞接种至六孔板，分为两组,实验组加入B16冻融上清，对照组加入等浓度等体积的PBS，实验组和对照组每组3个复孔，分别在培养48h和96h后对6孔板内细胞进行细胞计数。
1.4 MTT
1.5 统计学处理 SPSS
2 结果
2.1 冻融上清处理后，B16细胞体内转移成瘤能力增强
通过对两组小鼠肺表面形成转移结节数量的比较发现实验组肿瘤结节数明显比对照组多350±15(结果见图1)
对照组肺表面转移结节数：200±15
实验组肺表面转移结节数： 550±30
2.2冻融上清处理后，B16细胞体外增殖速度加快
48小时对两组细胞进行计数两组细胞数目差异不大，但当96h计数时培养液中加了B16冻融上清后，细胞增殖速度明显比对照组快；培养96h，实验组细胞数量比对照组高出54%，差异显著(结果见图2)，
2.3 冻融上清处理后，B16细胞体外增殖速度及活性上调
72h通过MTT法检测细胞活性也发现实验组OD值比对照组高出约56%(结果见图3)。
3讨论：
B16冻融上清对B16细胞在体内成瘤具有明显的促进作用，这种作用与不同的处理方式很大的关系，冻融上清也能促进B16细胞的体外增值。
【文内图片】
图1：两组小鼠15d后全肺照片 图2： 接种B16冻融上清后的培养液中的细胞计数
图3：B16冻融上清体外刺激B1672hMTT法检测细胞活性
参考文献：
1. Ren G, Dewald O, Frangogiannis NG. Inflammatory mechanisms in myocardial infarction. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2003, 2(3): 242-56.
2 .Dvorak HF, Dvorak AM, Manseau EJ, et al. Fibrin gel investment associated with line l and line 10 solid tumor growth, angiogenesis, and fibroplasia in guinea pigs. Role of cellular immunity, myofibroblasts, microvascular damage, and infarction in line 1 tumor regression. J Natl Cancer Inst. 1979, 62(6):1459-72.
3. Leek RD, Landers RJ, Harris AL, Lewis CE. Necrosis correlates with high vascular density and focal macrophage infiltration in invasive carcinoma of the breast. Br J Cancer. 1999, 79(5-6):991-5.
4. Matzinger P. Tolerance, danger, and the extended family. Annu Rev Immunol.1994,12:991一104
5. Sakurai T, Maeda S, Chang L, et al. Loss of hepatic NF-kB activity enhances chemical hepatocarcinogenesis through sustained c-Jun N-terminal kinase 1activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006, 103(28):10544-51.
6. Karin M, Lawrence T, Nizet V. Innate immunity gone awry: linking microbial infections to chronic inflammation and cancer. Cell. 2006, 124(4):823-35.
